當前的COVID-19疫情極大地加速了mRNA技術在我們現實世界中的應用，在這場戰斗中，mRNA證明了它與傳統生物制藥和疫苗技術相比的獨特優勢。為了克服人體生理環境中mRNA的不穩定性，mRNA的納米遞送系統是其體內應用的關鍵因素之一。納米遞送系統包括脂質遞送系統（脂質納米顆粒和脂質體）、聚合物復合物、膠束、陽離子肽等。總而言之，mRNA的應用范圍很廣，它的時代才剛剛開始。

一、 為什么需要納米遞送系統？

核酸的分子量比較大（104-106 Da）并且帶有負電荷，因此很難通過細胞的陰離子脂質雙層膜，此外，由于mRNA是單鏈大分子，較為脆弱，細胞外的存在也會限制mRNA的傳遞，例如被先天免疫系統中的吞噬細胞所吞噬或者被核酸酶降解，都會導致靶細胞攝取效率低，體內釋放不成功等問題。電穿孔、基因槍以及離體轉染可以向培養皿中的細胞遞送mRNA，然而，在實際人體中遞送時，則需要納米遞送系統，用以避免毒性以及不必要的免疫原性。

幸運的是，為了實現mRNA的有效遞送已經開發了許多基于材料的創新解決方案。目前最常用的納米遞送系統包括脂質納米顆粒（LNPs）、脂質體、脂質復合物、高分子聚合物、膠束、多肽、魚精蛋白、電穿孔等。LNPs和脂質體是最有前途的mRNA遞送工具之一。

二、 納米遞送系統

圖1.mRNA的遞送系統及應用

2.1 脂質納米顆粒（LNPs）

圖2.LNP結構示意圖

LNPs目前是基因治療的主要非病毒遞送載體。隨著LNP介導的siRNA治療劑Onpattro® (patisiran)獲批上市，mRNA遞送領域最先想到的就是采用LNPs遞送。 如圖所示：LNPs是一種具有磷脂單層結構的生物相容性載體，可以將mRNA包裹在核中以避免降解。除了帶負電荷的mRNA外，LNP通常還有其他四種成分：可電離的陽離子脂質、中性輔助磷脂、膽固醇和PEG化脂質。

中性輔助磷脂一般為飽和磷脂，可提高整體相變溫度和穩定性。

膽固醇具有很強的膜融合能力，促進細胞內mRNA的攝入和細胞質的進入。

PEG化脂質位于其表面以提高其親水性，避免被免疫系統快速清除，防止顆粒聚集，增加穩定性。

可電離的陽離子脂質，它是mRNA遞送和轉染效率的決定性因素。它需要在生理條件下（pH≈7.0）非電離，但在酸性條件下電離（pH=5.0）。此時叔胺頭部質子化，形成離子化頭部和疏水鏈尾部，進而形成錐形結構，促進內涵體/溶酶體膜向六方晶相轉變，實現高效遞送和轉染。羧酸酯的存在保證了陽離子脂質在體內的可降解性，避免了脂質聚集帶來的毒副作用。

LNP可通過快速混合進行制備，目前主流的方法是通過微流體制備，將含有mRNA的乙醇溶液添加到過量的水中，然后與脂質迅速混合，自組裝包裹mRNA后形成納米顆粒。

目前上市的兩款mRNA新冠疫苗使用的就是LNP遞送mRNA。

表1.兩款mRNA新冠疫苗LNP組分對比

除了上述兩款上市mRNA新冠疫苗中的兩款LNP，還有許多新型LNP在研發階段且極具價值。不同的材料對LNP的性質有很大的影響。

l Aguado課題組開發了四種具有不同成分的LNP用于mRNA遞送，并且通過對比，DOTAP作為陽離子脂質表現出較高的穩定性，并且伴隨著多糖的加入而提高了穩定性。

表2.不同配方的四種LNP

圖3.三種陽離子結構

l Davies課題組則發現，發現皮下注射含有mRNA的LNP時，可以在血漿中產生可測量的分泌蛋白，但會受到相關炎癥因子的影響。 為了克服這一局限，構建了由MC3陽離子脂質和L608陽離子脂質組成的LNPs，其蛋白表達持續時間延長，可實現慢性病治療性蛋白的系統水平穩定。

圖4.MC3和L608陽離子脂質結構

l Billingsley課題組研究了靶向治療嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）的療效，該療法具有誘導急性淋巴細胞白血病和B細胞淋巴瘤患者緩解的能力。然而，使用病毒載體可以誘導永久性的CAR表達，這可能會導致嚴重的不良反應。因此為了降低不良反應的毒性，他們設計了LNP用作mRNA體外遞送到人體T細胞中，并從24個可溶性脂質庫中發現7種能增強療效緩解癥狀的LNP。

圖5.A烷基鏈；B篩選庫；C合成反應

除此以外，還有更多課題組致力于LNP的研發，不同的LNP具有不同的靶向和效果，甚至有課題組設計研發出可霧化的脂質納米顆粒，用于肺部的疾病治療。

雖然LNP是mRNA遞送的最有效手段之一，但存在幾乎無窮無盡的設計空間，需要耗費大量人力物力及時間成本對其進行修改，以實現高效，無毒的靶向特定組織，器官或細胞的LNP制劑。此外，穩定性差使得mRNA-LNP的運輸和儲存成本很高。它的長期存儲也是發展mRNA-LNP體系需要重點考慮的問題之一。

2.2 脂質體

脂質體是由磷脂雙層形成的球形封閉囊泡。脂質體由A. D. Bangham于1965年首次發現，并長期用于小分子藥物遞送，粒徑范圍為20nm至1000nm。除了小分子化療藥物的封裝外，越來越多的研究集中在基因藥物（包括mRNA，pDNA，siRNA等），蛋白質藥物，激素藥物等脂質體的封裝和遞送能力上。陽離子脂質體帶正電荷，主要由陽離子脂質組成，陽離子脂質能夠以靶向方式有效地濃縮核酸。此外，通過改變陽離子脂質體的物理和化學性質，例如調整粒徑的大小和修飾陽離子脂質體的表面，可以在體內獲得良好的藥代動力學性質。一般來說，脂質體的制備方法包括薄膜分散法、溶劑注射法、冷凍干燥法、pH梯度法等

圖6.陽離子脂質體包封mRNA的結構示意圖

目前用于制備脂質體的材料眾多，包含特殊的陽離子脂質，磷脂以及實現脂質體隱形的PEG化脂質。

表3.用于mRNA遞送的脂質體常用材料

通過脂質體遞送mRNA有許多優點。首先，脂質體是球形囊泡，可以封裝mRNA并抵抗核酸酶。其次，脂質體與細胞膜相似，易于與受體細胞融合，轉染效率高。第三，作為一種遞送系統，脂質體不受宿主限制。最后，磷脂雙層膜結構高度模擬細胞膜。它是生物進化理論中已知的穩定結構，具有優異的長期儲存穩定性。

l Miche課題組通過薄膜分散法制備陽離子脂質體，并包封mRNA。脂質體由DC-CHOL / DOPE組成，該制劑即使在室溫下儲存80 d仍可以保持穩定。

l Kuznetsova課題組利用三苯基膦，采用非共價手段修飾后DPPC脂質體。與十四烷基咪唑烴尾表面活性劑相比，脂質體可以維持4個月以上的穩定性。

l Mai課題組通過薄膜分散法制備了由DOTAP/CHOL/DSPES-PEG組成的陽離子脂質體。將脂質體，mRNA和魚精蛋白以10：1：1的比例混合，形成了穩定的脂質體/魚精蛋白-mRNA復合物。通過鼻腔給藥，該脂質體核酸藥物顯示出極大的效率和刺激樹突狀細胞成熟的能力，并可以進一步誘導強烈的抗腫瘤免疫反應。

l Zhang R課題組用膽固醇修飾的陽離子多肽DP7對DOTAP脂質體進行了修飾。修飾后的DOTAP脂質體具有了跨膜結構和免疫輔助功能，同時也提高了個性化新抗原mRNA遞送的效率，并增強了激活樹突狀細胞（DC）的能力。

l Huang H課題組首先利用脂質體包裹了編碼RBD區域的mRNA，該mRNA脂質體復合物可以在體內表達RBD并成功誘導接種小鼠產生針對SARS-CoV-2的特異性抗體，有效的中和了SARS-CoV-2假型病毒。

然而，盡管mRNA已經成功地通過脂質體遞送，但脂質體也有一些缺點。與LNP相比，脂質體制備和mRNA包封的生產過程要復雜得多。一般來說，LNP和脂質體都是脂質納米顆粒。它們有許多相似之處，也有很大的不同之處。

表4.LNP和Liposome異同之處

2.3 聚合物復合物

高分子量聚合物材料（分子量10-106）化合物，通常是通過簡單結構單元之間的共價鍵反復連接形成叫高分子量的復合物，例如殼聚糖，聚乙烯亞胺，聚氨酯等。大多數用于mRNA遞送的聚合物材料需要通過修飾以提高其轉染效率和穩定性。聚乙烯亞胺（PEI）系統成功地將mRNA遞送到細胞和鼻腔內。

l Soliman課題組通過靜電絡合作用制備了含有mRNA的納米顆粒，其由不同程度的脫乙酰化和磺化高分子組成。結果表明，通過調節透明質酸和殼聚糖的聚合物長度和電荷密度，直接影響了與mRNA的親和力及其轉染效率

l Choia課題組則報道了一種mRNA遞送系統，該系統采用的是氧化石墨烯（GO）-聚乙烯亞胺（PEI）復合物。研究發現GO-PEI復合物對于mRNA的有效負載以及保護mRNA免受核酸酶的降解非常有效。GO-PEI/RNA復合物處理細胞的動態懸浮培養顯著提高了重編程效率。

l Chiper課題組通過化學修飾伯胺到芳香族結構域，制備了1.8 kDa的聚乙烯亞胺（PEI）顆粒。這種修飾不僅不會影響聚乙烯亞胺的緩沖能力，還可以增強其pH敏感聚集，穩定細胞外復合物，同時仍然允許核酸進入細胞后有效釋放。

圖7. Chiper課題組化學修飾PEI的化學結構

2.4 膠束

膠束是指在表面活性劑濃度達到水溶液中一定值后開始大量形成的有序分子聚集體。在膠束中，表面活性劑分子的疏水基團聚集形成膠束的核心，親水極性基團形成膠束的外層。

l Roloff 課題組研究了一種新型RNA聚合物兩親性分子組裝成球形膠束，直徑約為15-30nm，研究證明它們可以在不使用轉染試劑的情況下有效地進入活細胞。

圖8. Roloff 課題組研發的膠束

l Chan課題組則提出使用專門定制的多鏈氨基酸將mRNA靜脈遞送到小鼠的大腦中。這種結構最終將凝結成一個介于24至34nm之間的多鏈納米。然后，熒光素酶（Luc2）的mRNA作為報告基因通過體外轉錄（IVT）并隨后通過腦室內（ICV）注射將多鏈氨基酸注入小鼠大腦以繞過血腦屏障（BBB）。研究顯示，多重鏈納米結構表現出較好的mRNA遞送效率，并且沒有顯著的免疫應答記錄，可應用于腦部疾病的治療。

2.5 陽離子多肽

基于多肽的遞送是一種較少被探索的系統，目前只有魚精蛋白（CureVac的狂犬疫苗）在臨床試驗中被評估。新的遞送方法包括使用陽離子細胞穿透肽（CPP）和陰離子肽。CPPs系統已被證明可以改善體內T細胞免疫反應，調節先天免疫反應，并在體外增強DC和人癌細胞中的蛋白質表達。與陰離子肽偶聯的mRNA多鏈體在DC細胞中表現出細胞攝取的增加而不誘導細胞毒性。

圖9. 多肽遞送系統示意圖

鑒于mRNA的巨大應用潛力，隨著越來越多關于mRNA納米遞送系統研究的開展，勢必會有更多轉染效率更強、毒性更低、穩定性更好的新型遞送載體。

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核酸遞送路漫漫，一路都有AVT相伴。

Reference：

[1]. Li M, Li Y, Li S, Jia L, Wang H, Li M, Deng J, Zhu A, Ma L, Li W, Yu P, Zhu T. The nano delivery systems and applications of mRNA. Eur J Med Chem. 2022 Jan 5;227:113910. doi: 10.1016/j.ejmech.2021.113910. Epub 2021 Oct 8. PMID: 34689071; PMCID: PMC8497955.